【熊爸專欄】工作筆記-酵母基因定序 DNA Sequencing與雙雜交系統Reverse Two-Hybrid System

酵母雙雜交技術是一種用於檢測蛋白間相互作用的遺傳系統，最早由Song和Field在1989年建立。真核生物的轉錄活化因子通常擁有可分割的DNA特異結合域（BD）和轉錄活化域（AD）。為了完成活化特定基因的功能，活化因子必須同時含有這兩個結構域。基於這一原理，酵母雙雜交技術將兩個待測蛋白分別與BD和AD建成融合蛋白，共表達於同一個酵母細胞內。如果這兩個蛋白能相互作用，就會形成完整的轉錄活化因子，活化反饋基因的表達，通過對反饋基因的表型測定來判斷蛋白分子間是否發生相互作用。

酵母雙雜交系統包括BD融合的誘餌蛋白、AD融合的靶蛋白和帶有報告基因的宿主菌株。報告基因如HIS3、URA3、LacZ和ADE2等，而菌株則具有相應的缺陷型。系統根據BD的來源主要分為GAL4系統和LexA系統，後者由於來源於原核生物，可以減少假陽性。

自酵母雙雜交技術的建立以來，主要應用在以下幾個方面：

1. 檢驗已知功能蛋白間的相互作用

2. 研究蛋白相互作用所需的結構域

3. 用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質相互作用的傳遞途徑

4. 分析新基因的生物學功能，即以功能未知的新基因進行文庫篩選。

應用上常見問題包括假陽性較多和轉化效率偏低，為解決假陽性問題，需進行嚴格的對照試驗，使用多個反饋基因和整合反饋基因到染色體上，另外分析相互作用是否在細胞內自然發生也是必要的。酵母雙雜交技術還需處理假陰性現象，主要原因是融合蛋白對細胞有毒性或蛋白相互作用較弱，可通過選擇合適的菌株和載體來改進。

轉化效率是酵母雙雜交文庫篩選成功的關鍵，尤其對低豐度cDNA庫進行篩選時更為重要。共轉化是提高效率的有效方法，可以避免融合蛋白對細胞的毒性。此外，分別將誘餌蛋白和靶蛋白載體轉入不同接合型的單倍酵母，再進行雜交，也是提高轉化效率的有效手段。

在Hybrid技術下推出以M酵母為基礎的新式酵母，在白蘇維儂與黑皮諾的實驗中表現出差異非常大的風味表徵，在感官品飲上能夠產出更平衡豐沛變化的酒體。